+7 (495) 212-15-31

Разработка технологии и организация производства диагностических систем для перспективных

методов в ранней диагностики заболеваний на основе исследования молекулярных комплексов

сыворотки и плазмы крови методами спектроскопии квазиупругого рассеяния света

 

            Здоровье нации является основой развития страны. Однако, как отмечают исследования (Приложение 1), в России неуклонно возрастает число людей, страдающих сердечно-сосудистыми, онкологическими и другими тяжелыми заболеваниями. Это обусловлено многими факторами, среди которых не только неудовлетворительное состояние экологии, влияющее на состав потребляемых продуктов питания и воды, но и отсутствие должного контроля за их качеством, за качеством  лекарственных средств, пищевых добавок, бытовой химии, табачных изделий.

            Выявление тяжелых заболеваний на ранней стадии является приоритетной задачей для медицины. Наблюдается устойчивая тенденции роста онкологических заболеваний в мире. В этих условиях проблема ранней диагностики злокачественных новообразований и внедрение эффективных скрининговых методик является одной из приоритетных задач мирового сообщества.

      Если 30 – 40 лет назад основными причинами позднего выявления онкологических заболеваний являлись невозможность качест­венного обследования пациентов и недостаточная квалификация врачей, а также позднее обращение больных, то в последнее время среди причин запущенности опухолевого процесса возросла частота скрытого течения заболевания. Выявление и последующая диспансеризация лиц с опухолевыми заболева­ниями, а также лиц, отнесенных к группе повышенного онкологиче­ского риска, являются крайне актуальными, но требуют решения ряда технических, научно-методических и организа­ционных задач.

           Онкологические заболевания стали основной причиной смертности населения. Тенденции роста онкологических заболеваний в мире и в России, где  ежегодно регистрируется более 470 тысяч новых случаев злокачественных новообразований и около 300 тысяч смертей от них, выдвигают проблему ранней диагностики, внедрения эффективных скрининговых методик, надежных и доступных методов и средств динамического наблюдения больных, прошедших лечение, в ряд самых приоритетных задач современной онкологии. Ранняя диагностика онкологических заболеваний крайне актуальна и ее отсутствие в настоящее время наносит значительный материальный, моральный и социальный ущерб государству. Постоянно-периодический мониторинг здоровья всего населения страны создаст условия для оздоровления населения.

         С ростом количества больных людей, что само по себе является негативным, растет и экономическая нагрузка на общество, так как требуется увеличение затрат на их лечение. При этом также возрастает потребность в средствах и методиках, необходимых для обеспечения задач здравоохранения.

        В настоящее время онкологические заболевания, выявленные в ранних стадиях, подлежат практически полному излечению. Учитывая, что расходы на лечение пациентов в запущенных стадиях многократно превышают расходы на лечение заболеваний, выявленных на раннем этапе, решение задач ранней диагностики является чрезвычайно важным и существенно снизит экономическую нагрузку на общество.  Выявление тяжелых заболеваний на ранней стадии – основа для их устранения.

         На втором месте по смертности идут сердечно - сосудистые заболевания, ранняя диагностика и мониторинг которых тоже может иметь большой материальный, моральный и социальный результат.

         Развитие патологических процессов в организме сопровождается изменениями ряда молекулярных параметров биологических жидкостей. Исследования оптических свойств биополимеров, включая белки плазмы крови, показали эффективность использования метода квазиупругого рассеяния лазерного излучения для контроля этих параметров.

           В сыворотке крови пациентов присутствуют белково - липидные комплексы, которые были обнаружены при исследовании распределения размеров белков и белково-липидных комплексов в сыворотке крови с использованием метода квазиупругого рассеяния света. Как было показано на протяжении последних двадцати лет, распределение концентрации и размеров названных белково - липидных комплексов очень чувствительна к характеру протекания выше названных видов патологий и отражает их появление на ранней стадии.

 

        Рис 1. Спектр размеров молекулярных комплексов
 сыворотки крови здорового человека

 

На рис. 1. приведен вид рабочего экрана программы обработки результатов измерений интенсивности рассеяния света на белках и белково – липидных структурах, находящихся в плазме и сыворотке крови. В левом нижнем угле приведена гистограмма распределения размеров белково-липидных комплексов в сыворотке крови здорового человека.

Наличие таких комплексов было подтверждено в независимых экспериментах с использованием атомно-силового микроскопа. С этой целью образец сыворотки крови использовался для нанесения его на свежий скол слюды, специальным образом подготовленный для создания на нем активных центров, способных связывать белковые структуры. На рис. 2. и 3. показаны полученные на атомно-силовом микроскопе изображения комплексов, соответствующих пикам гистограммы на рис. 1.

Замечательной особенностью обнаруженных комплексов является их высокая чувствительность к любым изменениям, происходящим в организме человека. При возникновении патологий характер распределения размеров названных комплексов заметно изменяется. Для примера на рис. 4. приведена гистограмма распределения размеров названных комплексов в сыворотке крови пациента с сердечно – сосудистыми нарушениями.

 

Рис.2. Молекулярные комплексы
       сыворотки крови здорового пациента (образец1)

Рис.3. Молекулярные комплексы
      сыворотки крови здорового пациента (вариант 2)

        Рис. 4. Спектр размеров молекулярных комплексов
                 сыворотки крови пациента с сердечно – сосудистыми нарушениями.

           Рис 5. Молекулярные комплексы  сыворотки крови

           пациента с сердечно – сосудистыми нарушениями (вариант 1)

Рис 6. Молекулярные комплексы сыворотки крови

        пациента с сердечно – сосудистыми нарушениями (вариант 2)

 

         Рис 7. Молекулярные комплексы  сыворотки крови

             пациента с сердечно – сосудистыми нарушениями (вариант 3)

 

На рис. 5 – 7 представлены молекулярные комплексы  сыворотки крови того же пациента с сердечно – сосудистыми нарушениями, но полученные с использованием атомно-силового микроскопа.

Разработка технологии измерения концентрации и размеров молекулярных комплексов сыворотки и плазмы крови на основе метода спектроскопии квазиупругого рассеяния света предназначенна для создания на ее основе методов ранней диагностики заболеваний, в первую очередь, социально значимых заболеваний.

          В серии проведенных клинических испытаний основные диагностические характеристики (чувствительность, специфичность, эффективность) метода квазиупругого рассеяния света ложатся в интервал 80-90%. Таким образом, этот метод является достаточно эффективным, не зависящим от локализации опухоли методом для диагностики онкологических заболеваний и  возможного динамического наблюдения онкологических больных.

Состав разрабатываемой диагностической системы вытекает из разработанной в результате проведения клиничесих исследований «Инструкции по подготовке проб для тестирования» (Приложение 2)

Диагностическая система (в дальнейшем Система) состоит из технологических единиц:

1.      Спектрометра кваиупруго рассеянного света (КУРС);

2.      Центрифуги;

3.      Холодильника;

4.      Термостата;

5.      Автоматических пипеток - дозаторов;

6.      Смесителя.

          КУРС, как основное устройство, обеспечивающее успех проекта, предполагается более подробно рассмотреть в последующих разделах. Остальные компоненты Системы, предназначены для обеспечения строго стандартизованной процедуры подготовки пробы для дальнейшего исследования. Дело в том, что кровь является очень сложным объектом, многие свойства которого еще предстоит изучить в дальнейшем. Подлежащие исследованию комплексы, имея низкую концентрацию, являются еще к тому же плохо устойчивыми к разного рода воздействиям. Так, например, ультрацентрифугирование, широко применяемое в медицинских и биологических исследованиях для тонкого разделения фракций, приводит к их разрушению. Это же относится и к капиллярному электрофорезу. Инструкция, приведенная в Приложении 2 разработана на основе большого практического опыта исследования крупных молекулярных комплексов сыворотки и плазмы крови. Она рассчитана на стандартные методы взятия венозной крови у пациентов. Эти методы столь сильно укоренились в медицинской практике, что любое изменение их трудно внедрить в реальную практику. По этой причине на современном этапе методики строились под стандартные методы взятия крови. В то же время стандартные методы взятия крови влияют на некоторые ее тонкие свойства, что может стать предметом будущих исследований и построения на этом методик.. 

В проекте предполагается провести:

·         Разработку технологии оперативного измерения размеров и концентрации взвешенных в биологических жидкостях частиц в диапазоне размеров от 0,3 до 10000 нм с весовой концентрацией детектируемых частиц (к весу пробы для частиц размером 100 нм) от 10-8 до 10-3 

·         Разработку аппаратуры, обеспечивающей измерения необходимых для диагностики параметров на образцах нативной жидкости, подвергнутой минимальным внешним воздействиям после извлечения из живого организма.

·         Создание опытного образца системы исследования молекулярных комплексов сыворотки и плазмы крови методами лазерной спектроскопии квазиупругого рассеяния света для перспективных методов ранней диагностики заболеваний

 Как уже отмечено ранее спектрометр КУРС использует излучение, рассеянное квазиупруго на исследуемых объектах. Методы определения размеров дисперсных частиц на основе регистрации квазиупругого рассеяния света основаны на идентификации частиц по эффективному коэффициенту диффузии, а заключения об их размерах строятся на основе моделей, связывающих коэффициент диффузии частиц с их эффективным размером. Широкое распространение получила модель Стокса, связывающая подвижность частицы с ее характерными размерами и с вязкостью среды. В основе модели Стокса лежит решение задачи о движении сферической частицы в вязкой среде.

На рис. 8 приведена схема проведения измерений. Излучение лазера 1 попадает на ансамбль рассеивающих частиц 7, находящихся в диффузионном движении. Рассеянное на движущихся частицах излучение, содержащее гармоники, претерпевшие доплеровское смещение по частоте, анализируется фотоприемным устройством 3. В зависимости от угла рассеяния изменяется ширина спектра частот анализируемого сигнала.

Фиг. 8

На рис. 9 приведена качественная картина спектра рассеянного лазерного излучения. С двух сторон от основного пика 8, обусловленного Рэлеевским рассеянием, располагаются пики дублета Мандельштама-Брилюэна 9, каждый из которых сдвинут от основного пика на частоту, определяемую скоростью звука в непрерывной фазе, а ширина пика дублета Мандельштама-Брилюэна обусловлена скоростью затухания звуковых волн в этой среде.

Фиг. 9

Лазерное возбуждающее излучение наводит в среде, состоящей из молекул непрерывной фазы и взвешенных частиц, когерентную поляризацию, которая, в свою очередь, порождает рассеянное излучение. Тепловое движение молекул непрерывной фазы и броуновское движение взвешенных частиц дисперсной фазы приводит к потере (затуханию) когерентности поляризации и уширению спектрального контура рассеянного излучения. Широкая часть основного Рэлеевского пика обязана своим происхождением тепловому движению молекул непрерывной фазы. Взвешенные частицы имеют меньшую скорость диффузии и поэтому определяют большее время затухания возмущений, приводящих к меньшей ширине части спектрального контура, выделенной на рис. 9.

Фиг. 10

Разрабатываемое в составе Системы устройство для измерения распределения размеров и концентраций частиц в жидкостях и газах (рис. 10) содержит лазер 1. На пути луча от лазера 1 размещена кювета 2 для исследуемой жидкости, на выходе из которой установлен матричный фотоприемник 5 для регистрации излучения, рассеянного под малыми углами по отношению к падающему излучению. Под несколькими углами рассеяния относительно падающего луча расположены фотоприемные устройства 3 с узлами предварительной обработки сигналов, связанные с компьютером (на схеме не указан), в котором осуществляется обработка сигналов. Перед матричным фотоприемником 5, так же как и перед фотоприемниками 3 может быть установлен поляризатор 4, а перед лазером – устройство изменения плоскости поляризации 6.

Действие заявленного спектрометра происходит следующим образом. Луч лазера 1 мощностью от 1 до 100 милливатт поступает в кювету 2 с исследуемой жидкостью. Здесь луч частично рассеивается на микро или наночастицах, содержащихся в жидкости. Большая часть падающего излучения не рассеивается или рассеивается на малые углы. Это излучение регистрируется матричным фотоприемником 5. Малая часть луча, рассеявшись на большие углы на наночастицах, попадает на фотоприемные устройства 3. В зависимости от разрешенного направления поляризатора 4, расположенного перед фотоприемниками, на чувствительные элементы попадает излучение с вертикальной или горизонтальной поляризацией. Биения рассеянного оптического сигнала в фотоприемниках 3 превращаются во флуктуации фототока. Далее этот флуктуирующий электрический сигнал обрабатывается в компьютере. На пикселях фотоприемной матрицы 5 формируются сигналы, характеризующие малоугловую диаграмму рассеянного излучения. Результаты получаются после решения обратной задачи рассеяния. На экране монитора компьютера представляются итоговые результаты в удобном для пользователя виде, например, в виде графиков или таблиц, содержащих размеры и концентрации частиц в измеряемых жидкостях.

Фиг. 11

Устройство смены плоскости поляризации зондирующего лазерного пучка 6 служит для выбора горизонтального или вертикального направления плоскости поляризации падающего на исследуемую среду излучения. Оно может быть реализовано на разных принципах: механических – сменные поляризаторы, или электронных – устройства вращения плоскости поляризации, например, на основе эффекта Фарадея.

Биологические жидкости находятся в тонком равновесии, определяемом ионной силой раствора, значением рН и рядом других факторов. Названное обстоятельство исключает возможность изучения распределения размеров белков, липопротеинов и их комплексов в биологических жидкостях всеми классическими методами помимо разрабатываемого в рамках предлагаемого проекта.

         На рис.11 приведен вариант реализации описанного ранее устройства. В этом варианте луч гелий-неонового лазера рассеивается на частицах, взвешенных в жидкости, находящейся в круглой стеклянной кювете. Рассеянное излучение принимается на четыре фотоприемника, расположенных под углами, обеспечивающим наиболее полное получение информации об исследуемом ансамбле взвешенных субмикронных частиц.

Преимущества над имеющимися аналогами

В настоящее время размеры наночастиц, которым относятся белки плазмы и сыворотки крови, определяют в большинстве случаев с помощью электронных микроскопов и сканирующих зондовых микроскопов. Однако, стоимость электронных микроскопов высокого разрешения весьма велика (от 500 тысяч долларов США и более). Кроме того, они сложны в применении (подготовка пробы занимает несколько часов, исследование пробы - не менее 30 минут) и принципиально непригодны для исследования наночастиц, которые существуют только в жидкой фазе (например, многих наноструктурированных лекарственных препаратов и биологических жидкостей). С поправкой на меньшую цену, сказанное относится и к сканирующим зондовым микроскопам. Ввиду принципиальной невозможности оперативного проведения измерений и сложности пробоподготовки, использование таких приборов является сложной задачей.

Указанных недостатков лишены спектрометры квазиупругого рассеяния света (приборы КУРС). Они компактны, позволяют измерять распределение наночастиц по размерам непосредственно в жидкой среде, что необходимо для измерений характеристик сыворотки и плазмы крови, не требуют сложной подготовки проб.

Рис. 12. Приборы для измерения размеров наночастиц.

Возможности современных приборов для измерения размеров наночастиц приведены на рисунке 12. (по горизонтали – размеры измеряемых частиц в нанометрах, по вертикали – уровень стоимости приборов).

В России уже широко представлены зарубежные спектрометры квазиупругого рассеяния света. В основном закупаются приборы компании Malvern Instruments (www.malvern.com) Компания является мировым лидером по производству оборудования по измерению частиц. Анализаторы Zetasizer Nano позволяют измерять три параметра в приложениях по исследованию коллоидных, белковых систем и химии полимеров: размер частиц, дзета-потенциал и молекулярную массу.

Области применения:

·         анализ протеинов и полимеров,

·         исследование фармацевтических препаратов,

·         исследование наночастиц.

Одним из декларируемых достоинств прибора называют отсутствие необходимости разведения образцов, что обеспечивается исследованием рассеяния в направлении почти назад. В России представлено 4 разновидности аналитических приборов по измерению наночастиц:

·         Zetasizer Nano ZS,

·         Zetasizer Nano S,

·         Zetasizer Nano ZS90,

·         Zetasizer Nano S90.

       Производимое оборудование представляет из себя классический настольный коробочный вариант для определения размеров наночастиц. Также в России представлено дополнительное оборудование для анализаторов:

· Автоматический титратор MPT-2

· Вибровискозиметр SV-10

· Кюветы

Рис 13. Прибор Zetasizer Nano ZS

 

Непригодность приборов названной фирмы для решения задачи создания диагностической системы для обеспечения ранней диагностики социально значимых заболеваний показана в других разделах.

Здоровье нации является основой развития страны. Тенденции роста онкологических заболеваний в мире и в России выдвигают проблему ранней диагностики, внедрения эффективных скрининговых методик, надежных и доступных методов и средств динамического наблюдения больных, прошедших лечение, в ряд самых приоритетных. Ранняя диагностика онкологических заболеваний крайне актуальна и ее отсутствие в настоящее время наносит значительный материальный, моральный и социальный ущерб государству.

      На втором месте по смертности идут сердечно - сосудистые заболевания, ранняя диагностика и мониторинг которых тоже может иметь большой материальный, моральный и социальный результат.

       Известно, что число больных сахарным диабетом постоянно растет, а возраст вновь заболевших больных непрерывно снижается.

      Помимо медицинских задач предлагаемые разработки могут способствовать решению и ряда других актуальных проблем, связанных с созданием современных промышленных технологий. Так в соответствии с Программой развития наноиндустрии в Российской Федерации до 2015 года, российская промышленность должна занять 10-15% мирового рынка оборудования для наноисследований и наноиндустрии. Сегодня в России производятся сверхвысоковакуумные комплексы, зондовые нанолаборатории, сканирующие зондовые микроскопы. Отечественные предприятия поставляют их уже в 40 стран мира (www.ntmdt.ru www.nanotech.ru, www.aist-nt.ru, www.cryo.ru). Объем экспорта составляет около 1.5 млрд. рублей. Очевидно, что экспортный потенциал России целесообразно дополнить спектрометрами квазиупругого рассеяния света.

Область применения

Основная область применения разрабатываемой диагностической системы: ранняя диагностика и сопровождение лечения:

·         онкологии;

·         сердечно - сосудистых заболеваний;

·         сахарного диабета.

В медицине и биологии часто приходится иметь дело с биологическими жидкостями – коллоидными растворами белков, липопротеинов и различных их комплексов. К биологическим жидкостям относятся кровь, лимфа, ликвор, слюна, моча и т.д.

Биологические жидкости находятся в тонком равновесии, определяемом ионной силой раствора, значением рН и рядом других факторов. Названное обстоятельство исключает возможность изучения распределения размеров белков, липопротеинов и их комплексов в биологических жидкостях всеми классическими методами помимо разрабатываемого. Разрабатываемые приборы предназначены для анализа распределения размеров биологических нанообъектов в биологических жидкостях.

Если учесть, что в других разделах мы показываем наличие и большую роль белково-липидных комплексов крови в процессах жизнедеятельности, то становится ясной большая перспектива развития предлагаемых методов к исследованию свойств биологических жидкостей при ранней диагностике заболеваний.

Самые первые применения макетных образцов разрабатываемых приборов в вирусологии (см. Приложение 3) показали большую перспективу нового метода. Размер вируса имеет важное самостоятельное значение. Это не просто еще один измеряемый параметр вируса, это отличительный метрологический признак и характеристика, важный как для идентификации вируса, так и для характеристики штамма вируса.

Перспективные результаты получены при исследовании комплексов на основе порфиринов (см. Приложение 4) Способность порфиринов и их металлокомплексов накапливаться в злокачественных опухолях лежит в основе фотодинамической терапии и лазерной диагностике онкологических заболеваний. Избирательность доставки порфиринов в раковые клетки увеличивается при использовании коньюгатов металлокомплексов порфиринов (МКП) с сывороточными альбуминами. Альбумин плазмы крови является одним из главных транспортных белков в организме.

Широкое применение спектрометры найдут для контроля размеров липосомальных и мицелярных фармпрепаратов при их производстве и хранении.  

Возможные дополнительные области применения !!!

Следует особо выделить перспективу использования разрабатываемых комплексов в медицине и биологии при создании нановакцин и нанолекарств на основе гибридных наночастиц (наночастиц – носителей  с прикрепленными к ним биологическими молекулами -лекарственными препаратами, генами, белками, пептидами и т.д.). При этом распределение наночастиц в биологических тканях  и их функционирование зависят как от свойств капиллярной сети конкретного органа или ткани-мишени, так и от размеров и поверхностных свойств наночастиц.

Дисперсные частицы по условиям их получения и/или существования, как правило, не являются монодисперсными. Поэтому количественная информация об их фракционном составе, то есть о распределении частиц по размеру, требуется на всех стадиях создания и производства продукции. Измерения необходимо производить надежно, быстро и оперативно (в масштабе времени, близком к реальному).

В настоящее время размеры микронных частиц определяют с помощью оптических микроскопов и дифрактометров, а наночастиц - в большинстве случаев с помощью электронных микроскопов и сканирующих зондовых микроскопов. Однако, стоимость электронных микроскопов высокого разрешения весьма велика (от 500 тысяч долларов США и более). Кроме того, они сложны в применении и принципиально непригодны для исследования частиц, которые существуют только в жидкой фазе (например, многих наноструктурированных лекарственных препаратов и биологических жидкостей). С поправкой на меньшую цену, сказанное относится и к сканирующим зондовым микроскопам. Ввиду принципиальной невозможности оперативного проведения измерений и сложности пробоподготовки, использование таких приборов в производственном процессе является очень сложной задачей. Еще более сложной выглядит задача по их адаптации в технологический процесс производства наночастиц.

      Указанных недостатков лишены спектрометры, основанные на рассеянии света. Они позволяют измерять распределение частиц по размерам непосредственно в жидкой среде, не требуют сложной подготовки проб и могут применяться в промышленном производстве.

В настоящее время 34% предприятий российской наноиндустрии работает в сфере наноматериалов. Еще около 15% занимается нанобиотехнологиями. Все эти компании остро нуждаются в доступных средствах измерения размеров наночастиц. Только на оснащение центров коллективного пользования уникальным оборудованием в России расходуется ежегодно около 1 млрд. руб. Эти центры также должны быть оснащены современными спектрометрами квазиупругого рассеяния света.

Комплекс разрабатываемых в проекте методов позволит создать уникальный по своим характеристикам для исследования материалов, вовлеченных в Программу развития наноиндустрии в Российской Федерации до 2015 года (Постановление от 2 августа 2007 г. N 498 О федеральной целевой программе "Развитие инфраструктуры наноиндустрии в Российской Федерации на 2008 - 2010 годы") и будет способствовать ее успешному выполнению. Такими аппаратами могут быть оснащены рабочие места исследователей, участвующих в Программе. Они незаменимы на этапе технологических разработок в качестве аппаратов входного, и выходного технологического контроля при создании различных наноструктур.

       Предлагаемый к разработке измерительный комплекс помимо оперативности и дешевизны проведения измерений позволяет сразу получать статистические распределения размеров исследуемых дисперсий. Большинство современных технологий получения наночастиц предполагают использование процессов в жидкостях (гидроудары, использование ультразвукового диспергирования, метод золь-гель и др.) В этом случае предлагаемый метод органично встраивается в технологические цепочки, так как не требует длительных процедур подготовки пробы, что необходимо в альтернативных методах (в методах с использованием электронных и атомно-силовых микроскопов). Метод незаменим, когда необходимо исследовать нанообъекты, которые существуют только в виде растворов и взвесей. К таким нанообъектам относятся большинство косметических средств и современных фармпрепаратов. В этом случае к разработке измерительный комплекс не имеет конкурентов.

Описание изделий, сфера применения

В настоящее время широкое распространение получила спектроскопия динамического (квазиупругого) рассеяния света. Она уже представляет в значительной степени развитую экспериментальную методику, используемую как вариант спектроскопии высокого разрешения. Приборы, работающие на этом принципе, выпускаются несколькими производителями (Malvern - Zetasizer Nano ZS, Photocor - Photocor Complex, Particle Sizing Systems Nicomp)

        В то же время, эти приборы плохо подходят для решения задачи медицинской диагностики, так как, как было отмечено ранее, они плохо приспособлены для исследования полидисперсных сред. Для построения адекватного метода исследования крупных молекулярных комплексов плазмы и сыворотки крови необходим прибор, способный исследовать среду, содержащую очень широкий диапазон размеров взвешенных частиц. Основными белками плазмы и сыворотки крови являются альбумины и глобулины, имеющие характерные размеры 7 и 9 нм соответственно. Исследуемые нами комплексы имеют относительную весовую концентрацию меньше 10-4 и размеры в диапазоне от десятков до сотен нанометров. Необходимо одновременно видеть тонкости изменения распределения размеров альбуминов, глобулинов и белково-липидных комплексов в широком диапазоне размеров и концентраций, что приводит к очень высоким требованиям к техническим параметрам разрабатываемого спектрометра КУРС.

 

Экспертная оценка закупки в России за 2010 г. изделий, аналогичных разрабатываемому, млн руб

В связи с ростом числа страдающих онкопатологией возрастает нагрузка на бюджет. В настоящий момент раковые заболевания, выявленные в ранних стадиях,  подлежат практически полному излечению. Пациенты, у которых заболевание выявлено до фазы T1N0М0, переживают 5-летний барьер в 90% случаев и подлежат снятию с диспансерного учета.

Однако даже в наиболее развитых странах с развернутой системой обязательного диспансерного наблюдения (в зависимости от страны, 1 или 2 раза в год) редко удается выявить больных ранее T2N2M0, значительно чаще это происходит в более поздних стадиях, при этом затраты на лечение пациента в запущенных формах кратно превышают таковые для ранних форм.

Таким образом, решение задач ранней диагностики увеличит как число выживших (>5 лет), так и резко сократит нагрузку на бюджет.

    Средняя стоимость жизни пациента с онкологическим заболеванием, прооперированного в фазах T3N1M0, T3N2M0 (третья стадия), составляет от 18000 до 54000 USD в год. Сюда входит стоимость химиотерапии, лучевой терапии, поддерживающей терапии и т.д. Стоимость оперативного лечения колеблется в пределах от 1000 до 25000 USD.

Разрабатываемая своевременная диагностика позволит выявить пациента в стадии T1N0M0 и далее. В случае если локализация заболевания не будет выявлена сразу, находясь под пристальным вниманием врачей, пациент имеет все основания на установление диагноза в течение 6 месяцев. Соответственно снижается стоимость и тяжесть оперативного вмешательства, количество курсов химиотерапии и характер применяемых во время нее препаратов.

Стоимость одной капельницы наиболее распространенного препарата для химиотерапии «Таксотер» - 1250 USD (на курс требуется 6 капельниц), без стоимости всех остальных препаратов, работы медсестры и т.д. У прооперированного в стадии T1N0M0 пациента количество капельниц на курс составит 3, а количество курсов – 1, в сравнении с 2 – 3 – 6-ю для пациентов в стадии T3N1M0. К тому же своевременно прооперированному пациенту можно проводить лечение «старыми» генерациями препаратов, где стоимость курса составит 200 – 300 USD на курс в сравнении с 1250 х 6 = 7500 USD при лечении более поздней стадии заболевания (только по основным препаратам).

         По данным Research.Techart, объем российского рынка измерительного оборудования (сюда включены электронные и сканирующие зондовые микроскопы, а также лазерные корреляционные спектрометры) в 2008 году составил 1.8 млрд. руб. Рынок аналитического измерительного оборудования демонстрирует устойчивую тенденцию к росту: в период с 2007 по 2008 году рост сектора находился на уровне порядка 40-50%.

           В структуре продаж оборудования для определения размеров наночастиц в России преобладают электронные и сканирующие зондовые микроскопы.

          Сегмент лазерных корреляционных спектрометров (альтернативное название для спектрометров квазиупругого рассеяния света) в настоящий момент занимает нишевое положение на рынке: на них приходится только около 1% от его общего объема. По оценкам Research.Techart до 2007 года в Россию не завозились зарубежные спектрометры квазиупруго рассеянного света. Объем российского рынка этих спектрометров в 2008 году составил 37-40 млн. рублей, что в два раза превысило объем 2007 года. В дальнейшие годы объем закупок рос такими же темпами. Лидирующее положение в поставках спектрометров занимают компании Malvern Instruments (www.malvern.com), Photocor Instruments (www.photocor.com) и Microtrac (www.microtrac.com). В последующие годы закупка иностранных приборов в России существенно (в разы) выросла, однако фактической информации в Интернете нам найти не удалось.

В России в основном закупаются приборы компании Malvern Instruments (www.malvern.com) Компания является мировым лидером по производству оборудования по измерению концентрации наночастиц. Анализаторы Zetasizer Nano позволяют измерять три параметра в приложениях по исследованию коллоидных, белковых систем и химии полимеров: размер частиц, дзета-потенциал и молекулярную массу.

Области применения:

·         анализ протеинов и полимеров,

·         исследование фармацевтических препаратов,

исследование наночастиц.

Рис 14. Структура рынка приборов для определения размеров наночастиц в России в 2008 году, штук (источник: Research.Techart)

 

Одним из достоинств прибора называют отсутствие необходимости разведения образцов, что обеспечивается исследованием рассеяния почти назад. В России представлено 4 разновидности аналитических приборов по измерению наночастиц:

·         Zetasizer Nano ZS,

·         Zetasizer Nano S,

·         Zetasizer Nano ZS90,

·         Zetasizer Nano S90.

       Производимое оборудование представляет из себя классический настольный коробочный вариант для определения размеров наночастиц. Также в России представлено дополнительное оборудование для анализаторов:

· Автоматический титратор MPT-2

· Вибровискозиметр SV-10

· Кюветы

           Потребители модели Zetasizer Nano ZS: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина", ФТИ им. А.Ф. Иоффе РАН, Центр коллективного пользования "Технологии получения новых наноструктурированных материалов и их комплексное исследование" МГУ (ЦКП МГУ), ФЦКП Физико- химических исследований веществ и материалов. Zetasizer Nano S: Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук.

           Создание приборов для нанотехнологий является одним из основных направлений развития наноиндустрии. Продажи спектрометров квазиупругого рассеяния света зарубежных производителей уверенно растут (около 8% в год).

Необходимость разработки специализированного измерительного прибора обусловлена тем, что в России в области создания и производства наноматериалов уже сегодня работают более 80 компаний, имеется около 60 центров коллективного пользования. По планам ГК Роснанотех создаются центры стандартизации и сертификации нанотехнологий системы "НАНОСЕРТИФИКА", для оснащения которых также целесообразно использовать спектрометры квазиупруго рассеянного света. Применение дорогостоящих электронных микроскопов и сканирующих зондовых микроскопов с необходимостью привлечения персонала высшей квалификации в этих целях не оправданно.

 

Оценка потребности в изделиях, аналогичных разрабатываемому, млн руб. в год

Проникновение нанотехнологий в повседневную жизнь протекает высокими темпами. Если еще недавно слова Президента РФ о необходимости начать изучать нанотехнологии со школьной скамьи казались крайне революционными, то сейчас в официальных изданиях заявляется, что «в каждой московской школе в ближайшем будущем могут появиться кабинеты нанотехнологий и робототехники.» (http://m.mos.ru/press-center/smi/index.php?id_4=5380) Вопрос о финансировании таких проектов рассматривается в департаменте образования Москвы.  С учетом того обстоятельства, что в РФ около 50 тыс. школ, рынок приборов для измерения параметров наночастиц можно в перспективе оценивать в несколько млрд. руб.

      Первые медицинские применения спектрометров динамического рассеяния света уже имеют более чем десятилетнюю историю. При условии разработки надежных приборов в силу простоты проведения теста по содержанию и составу белков в крови, разрабатываемая диагностическая Система может найти место в каждой больнице России. При возможной стоимости Диагностической системы ранней диагностики заболеваний 1 – 2 млн. руб. объем рынка может быть оценен в несколько десятком млрд. руб. К тому же, как было отмечено ранее, спектрометры кваиупруго рассеянного света могут иметь и самостоятельное применение в других областях, вплоть до ранее названных программ приборного оснащения школ.

В настоящее время наноразработки ведутся практически во всех отраслях промышленности, поскольку применение наноматериалов способно изменить свойства традиционных продуктов, повысить конкурентноспособность товаров на рынке.

Быстрое развитие научных исследований в области нанотехнологий отражается в росте потока публикаций и росте числа патентов на изобретения.

Число публикаций в области нанотехнологий в 2007 году:

·           США -15.000 статей;

·           Европа - 12.000;

·           Китай -10.000.

По общему количеству патентов в области нанотехнологий лидирует США - около 40% всех выданных в мире патентов (количество изобретений в области нанотехнологий превышает 3 тыс.).

Нанотехнологии применяются в процессе производства, десятков потребительских товаров и сотен видов сырьевых материалов, комплектующих изделий и промышленного оборудования. Среди них (по данным research.techart):

·           281 медицинский продукт;

·           61 наименование пищевых продуктов и напитков;

·           58 продуктов для дома и сада;

·           42 товара из области электроники/компьютерных товаров;

Сегодня на полученную с использованием нанотехнологий продукцию приходится около 0.5% мирового ВВП. Многие крупные корпорации, например, IBM, Motorola, HP, Lucent, Hitachi USA, Corning, DOW, вкладывают средства в развитие нанотехнологий.

Области разработок на современном этапе делятся на шесть основных категорий:

·           обработка и получение наноматериалов;

·           нанобиотехнология;

·           программное обеспечение;

·           нанофотоника;

·           наноэлектроника;

·           наноприборостроение.

Мировой рынок нанотехнологий имеет устойчивую тендецию роста. Согласно прогнозу Research And Markets до 2013 года Азиатско-Тихоокеанский регион будет испытывать сильнейший рост рынка нанотехнологий и рынка товаров, стоимость которых включает нанотехнологию (nano enabled goods) со среднегодовым темпом прироста (CAGR) 52%. Следом за этим регионом по темпам развития будет выступать Европа. Политика развивающихся стран в области нанотехнологических R&D (НИОКР) (Россия, Индия, Китай) будет ключевым фактором в росте их рынков.

Нанотехнологиями активно занимаются все развитые страны. Они рассматривают поддержку развития соответствующих научно-технологических направлений, а также практическое внедрение их результатов, как один из важнейших государственных приоритетов.

К настоящему времени в мире резко выросли объемы инвестиций государств и корпораций в исследования и разработки, связанные с НТ. Вместе с этим увеличивается количество научных разработок, патентов и публикаций. За последние годы создано свыше 16000 НТ-компаний, число их удваивается каждые 1,5 – 2 года.

Среди развитых стран уже сложилась определенная политика в области нанотехнологий. Она заключается в развитии стратегии: «Bringing product from laboratory to the market» — перенесение продукта из лаборатории на рынок. Этим занимаются не только государственные, но и многие частные организации, в результате процесс появления новых продуктов, содержащих НТ-улучшения, происходит достаточно быстро.

В соответствии с Программой развития наноиндустрии в Российской Федерации до 2015 года, российская промышленность должна занять 10-15% мирового рынка оборудования для наноисследований и наноиндустрии, к 2015г. российская отрасль нанотехнологий вырастет в 120 раз.

 

Прогноз продаж в России и государственных закупок разрабатываемого изделия на 10 лет с момента вывода на рынок

Приборы зарубежного производства вынуждены закупать российские организации (в частности, высшие учебные заведения и научно-исследовательские институты).

Продажи спектрометров квазиупругого рассеяния света зарубежных производителей уверенно растут (около 8% в год). Годовая операционная прибыль крупнейших производителей спектрометров квазиупругого рассеяния света (PANanalytical и Malvern Instruments) в 2007г. выросла на 15%.

На первом этапе можно рассчитывать на вытеснение иностранных приборов с российского рынка при создании серийного производства своих приборов более высокого качества.

        Мировая потребность в спектрометрах имеет тенденцию к росту примерно 8% в год, если анализировать данные по продажам компаний PANanalytical и Malvern Instruments за период 2001-2007гг. Потребность России оценивается в 100-200 спектрометров в год при наличии доступных моделей. Потребители аппаратуры - предприятия наноиндустрии, высшие учебные заведения, научно-исследовательские институты, центры коллективного пользования, а также предприятия других отраслей промышленности, использующие наноматериалы. Разработка спектрометра квазиупруго рассеянного света повлияет на структуру потребления из-за распространения нового дешевого отечественного прибора. Качество услуг значительно вырастет из-за наличия более широких возможностей и точности измерений, что приведет ускорению внедрения наноматериалов в промышленное производство.

         Перспективы внедрения рассматриваемых приборов для медицинского применения приводят к оценке потребностей таких приборов до нескольких тысяч в год.

Интеллектуаль­ная собственность

Номера и даты патентов

1.      1 Патент RU2370752 от 22 08 2008г. УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗМЕРОВ И КОНЦЕНТРАЦИЙ НАНОЧАСТИЦ В ЖИДКОСТЯХ И ГАЗАХ.

2.      Патент RU49620 от 11 07 2005г. УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ КЛАСТЕРОВ И МИКРОЧАСТИЦ В ЖИДКОСТЯХ

3.      Патент RU2414693 от 18 03 2009г. ОПТОВОЛОКОННЫЙ ИЗМЕРИТЕЛЬ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗМЕРОВ И КОНЦЕНТРАЦИЙ НАНОЧАСТИЦ В ЖИДКОСТЯХ

4.      Патент RU84548 от 19 03 2009г.  УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗМЕРОВ И КОНЦЕНТРАЦИЙ НЕСФЕРИЧЕСКИХ НАНОЧАСТИЦ В ЖИДКОСТЯХ И ГАЗАХ

5.      Патент RU2323433 от 23 01 2006г. ЛАЗЕРНЫЙ МИКРОВИБРАЦИОННЫЙ СПЕКТРОМЕТР

6.      Патент RU2408280 от 15 12 2005г.  УСТРОЙСТВО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ

7.      Патент RU2373846 от 11 04 2008г.  УСТРОЙСТВО ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ КРОВИ

8.      Заявка на изобретение №2006118948 от 01 06 2006г. СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

9.      Заявка на изобретение №2012145430 от 26 10 2012г. Способ и устройство для оптического измерения распределения размеров и концентраций дисперсных частиц в жидкостях и газах с использованием одноэлементных и матричных фотоприёмников лазерного излучения

Конкурентная среда

Основные имеющиеся в России изделия с аналогичной областью применения (для лечения данного заболевания) и их производители

В России спектрометры квазиупругого рассеяния света "ЛКС-03" в единичных экземплярах производит ООО «Интокс» (http://intoks.ru/index.php). Базовая конструкция этого прибора разработана в 90-х годах и в настоящее время устарела. Вследствие существования обратных бликов и отсутствия системы стабилизации излучения, в режиме работы лазера возникают неустойчивости, приводящие к искажениям амплитудно-частотной характеристики в районе 22 кГц. Названные неустойчивости существенно ограничивают возможности данного прибора и приводят к артефактам. Прибор не способен измерять наночастицы размером в единицы нанометров при малых концентрациях в суспензии. В то же время на данном приборе получено большинство предыдущих результатов по изучению плазмы и сыворотки крови методом квазиупругого рассеяния света. Недостатки названного прибора были нами частично устранены в наших последующих разработках, однако, прибор, удовлетворяющий нужным для получения надежных результатов критериям, должен еще быть разработан на основе более современной элементной базы, появившейся в последнее время. 

Известные заявителю исследования и разработки, проводимые по аналогичной тематике в России и за рубежом

Приборы на основе квазиупругого рассеяния света производят несколько зарубежных фирм: Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания http://www.malvern.com/), Photocor Complex (Photocor Instruments, США http://www.photocor.com/), Nicomp 380 (Particle Sizing Systems, США http://www.pssnicomp.com/) Однако, эти приборы не приспособлены для получения достаточно надежных результатов для изучения плазмы и сыворотки крови

Оценка конкурентоспособности разрабатываемой продукции (сравнительный анализ технико-экономических показателей с аналогами, в том числе стоимость владения в послепродажный период)

Приборы на основе квазиупругого рассеяния света производят несколько зарубежных фирм: Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания http://www.malvern.com/), Photocor Complex (Photocor Instruments, США http://www.photocor.com/), Nicomp 380 (Particle Sizing Systems, США http://www.pssnicomp.com/).

Используемые в существующих спектрометрах технические решения (как правило, используется фотоэлектронный умножитель в режиме счета фотонов) не позволяют обеспечить необходимую оперативность измерений (время измерения одной пробы составляет 10 - 30 минут).

Особо нужно упомянуть о необходимости исследования характеристик полидисперсных сред. В реальной ситуации очень редко встречается задача определения размеров монодисперсных частиц. Более того, даже в случае работы с монодисперсными частицами, как правило, встает вопрос об их загрязнении крупными агрегатами. В то же время, существующие приборы квазиупругого рассеяния света плохо приспособлены к исследованию полидисперсных сред. По этой причине даже параметры по точности и повторяемости результатов измерений приводятся разработчиками для монодисперсных сред. Переход к полидисперсным средам для рассматриваемого способа измерения концентрации и размеров наночастиц является сложным в силу необходимости решения плохо обусловленной математической задачи восстановления параметров рассеивателей по результатам измерения характеристик рассеяния.  При исследовании характеристик плазмы и сыворотки крови методами рассеяния света, как показано ранее, мы имеем дело с набором рассеивателей с сильно различающимися характеристиками.

Подавляющее большинство существующих ныне спектрометров обладает двумя значительными недостатками. Во-первых, приборы на основе квазиупругого рассеяния света с ФЭУ, работающим в режиме счета фотонов, обладает крайне малым рабочим диапазоном интенсивностей рассеяния притом, что интенсивность рассеяния может меняться на много порядков величины от образца к образцу. Сверху этот диапазон ограничен линейностью выходного потока импульсов на уровне 300 – 1000 кГц, при котором время одного измерения составляет десятки- единицы минут, а снизу – разумным максимальным временем измерения – несколько часов (скорость счета 10 – 20 кГц). Эти обстоятельства либо накладывают особые условия на подготовку пробы потребителем так, чтобы на ней было возможно проводить измерения (в более дешевых версиях прибора) либо заставляют производителя оснащать спектрометр сложными и капризными опто-электронно-механическими устройствами регулировки падающей на среду мощности (в дорогих версиях). Предлагаемые в настоящем проекте решения по спектрометру на основе квазиупругого рассеяния света лишены указанных недостатков.

          Немаловажным с точки зрения удобства и стоимости применения приборов на основе квазиупругого рассеяния света является то обстоятельство, что пробоподготовка для измерений на приборах, использующих ФЭУ, а именно такими являются все приборы, изготавливаемые зарубежными производителями, должна проводиться в специальных особо чистых помещениях и с использованием сложных процедур мытья измерительных кювет. Это связано с тем, что наличие даже 1- 2 пылинок в обмеряемом растворе способно свести на нет результаты получасовых - часовых измерений. Идеология, заложенная в спектрометры на основе квазиупругого рассеяния света, представленные в настоящем проекте, не накладывает практически никаких ограничений на процесс пробоподготовки, что делает использование предлагаемого прибора намного более простым, быстрым и дешевым

 

Стадия разработки,  описание проведенных исследований

 

Исследованиям применений спектроскопии квазиупруго рассеянного света в медицине уже около двух десятков лет. Выпущены книги и пособия для врачей. Так можно назвать брошюру: «Инструкция по применению в медицинской практике» УИЕЮ.941 412. 003 Д1 от 12.04.1997, в которой дается ссылка на «Спектрометры лазерные корреляционные компьютеризированные для определения размеров микрочастиц в биологических жидкостях ЛКС-03-"ИНТОКС". Спектрометры зарегистрированы в Госреестре под номером 17649-04. Спектрометры предназначены для измерения диаметров частиц в растворах при исследовании сыворотки и плазмы крови, ликвора, мочи и других биологических жидкостей.

          Большая работа проведена по применению названных спектрометров для диагностики сахарного диабета (Применение лазерной корреляционной спектроскопии для исследования субфракционного состава мочи у больных сахарным диабетом 2 типа, Пособие для врачей, Санкт-Петербург 2004, Под общей ред. проф. С.Б.Шустова и проф. В.Л.Эмануэля - СПб., 2004.).

        В Уральском научно-практическом центре радиационной медицины (директор А.В.Аклеев)  большая работа проведена по обследованию с использованием спектроскопии квазиупруго рассеянного света тысяч пациентов, получивших дозу радиации при аварии на заводе «Маяк» на Урале.

         Большой объем работ был проведен в Российском Онкологическом Научном Центре и в МГУ. Эти работы проводились на спектрометрах квазиупругого рассеяния самых ранних моделей, имеющих ограниченные возможности, как по динамическому диапазону, так и по спектральному диапазону измеряемых спектров сигналов от рассеянного излучения. Получаемые спектры рассеяния не позволяли проводить математическую обработку с целью построения заключений о размерах объектов, принимающих участие в рассеянии. Но уже на этих ранних стадиях были сделаны заключения о достоверных деформациях спектров рассеяния излучения на образцах плазмы и сыворотки крови при наличии онкологических заболеваний.

Экспериментальные исследования показали, что спектры частот сигналов излучения, рассеянного в сыворотке крови пациентов с онкологическими заболеваниями, группируются в области более низких частот по сравнению с аналогичными  спектрами, полученными для сыворотки крови здоровых лиц. При этом максимальная интенсивность рассеяния в сыворотке крови онкологического больного, как правило, в несколько раз выше максимальной интенсивности рассеяния в сыворотке крови здорового донора. (см. рис. 15)

Рис.15. Усредненные спектры квазиупругого рассеяния излучения в плазме крови онкологических (красный),

не онкологических (черный) больных и здоровых (зеленый) доноров.

Когда пациенты обследовались в процессе лечения, наблюдалось последовательное приближение показателей спектров рассеяния к норме, что полностью соответствовало положительной динамике изменения синхронно полученных клинико-гематологических показаний. Последнее имеет важное прогностическое значение для оперативного определения ближайшей тактики лечения.

            В процессе проведения названных работ нами создано несколько поколений экспериментальных и опытных образцов приборов для измерения размеров наночастиц методами квазиупругого рассеяния света.

 

Рис.16. Опытный образец приборного комплекса – прототипа прецизионного

лазерного спектрометар динамического рассеяния.

На рисунке 16 представлен опытный образец приборного комплекса – прототипа прецизионного лазерного спектрометра динамического рассеяния света. В качестве источника возбуждающего излучение в нем используется NeHe лазер. В отличие от большинства выпускаемых приборов, в которых измерение размера наночастиц проводится на основе обработки корреляционной функции,  в данном варианте прибора используемое математическое обеспечение позволяет решить обратную задачу рассеяния и построить распределение рассеивающих наночастиц по размеру на основе обработки спектра флуктуаций мощности рассеянного излучения.

Рис.17. Опытный образец приборного комплекса –спектрометара

 динамического рассеяния на основе лазерного диода

 

Опытный образец компактного спектометра с лазерным диодом в качестве источника возбуждения рассеяния показан на рисунке 17.

          Представленные приборы были использованы для широкой гаммы исследований, проведенных с плазмой и сывороткой крови онкологических больных с широким спектром нозологий и с различными стадиями заболеваний. Большую перспективность показала методика сопровождения заболеваний и оперативной коррекции методов лечения основываясь на результатах исследований методом спектроскопии квазиупругого рассеяния света.

Рис 18. Гистограммы сыворотки крови онкологических больных

с различными нозологическими формами заболевания.

Рис. 19. Типичные АСМ-изображения выделенных молекулярных комплексов в

сыворотке онкологических больных.

 

              Было показано, что устойчивость крупных 80-300 нм компонентов (характерных для онкологических заболеваний) к различным внешним воздействиям также различна. Это создает базу для разработки различных вариантов диагностических методик.

             Методика многопараметрической диагностики онкологических заболеваний на основе квазиупругого рассеяния света в сыворотке (плазме) крови была апробирована в ряде ведущих исследовательских и лечебных онкологических учреждений: РОНЦ им. Н.Н. Блохина, РМНЦ (Обнинск), кафедре радиологии Академии последипломного образования врачей, МОНИКИ. Проведённые пилотные исследования показали достаточно высокую диагностическую эффективность метода. Основные диагностические показатели (чувствительность, специфичность, точность) в различных сериях испытаний располагались в интервале (84 - 94)%, что значительно выше показателей  иммунных тестов с помощью онкомаркеров.

В практике научно-лечебных онкологических учреждений эти методики могут быть использованы как в качестве дополнительного диагностического теста при амбулаторном обследовании первично поступающих пациентов, так и для объективизации оценки эффективности проведенного противоопухолевого лечения и последующего онкологического мониторинга в ходе диспансерного наблюдения.

           Все эти работы показали перспективность развития данного направления медицинской диагностики. Однако в новых условиях наши старые разработки спектрометров квазиупруго рассеянного света уже исчерпали свой потенциал

 

Качественные и количественные характеристики изделия, (технические, функциональные, эксплуатационные, экономические и т.п.)

Технические характеристики:

·           размер детектируемых частиц – от 0.3 до 10000 нм

·           весовая концентрация детектируемых частиц (к весу пробы) – до 10-8

·           термостатируемый кюветный узел - должен позволять использование широкого класса кювет, в том числе и кювет одноразового использования, что часто бывает принципиально при работе с биологическими объектами или при работе с особо чистыми веществами. Используемый объем пробы должен быть в пределах от 100 до 1000 мкл. В процессе выполнения проекта будут отработаны возможности расширения диапазона без ухудшения эксплуатационных характеристик.

·           время отдельного измерения - не более трех минут.

·           компьютерное управление сбором обработкой и отображением данных с программным пользовательским интерфейсом интеллектуального уровня с возможностью формирования банка данных.

·           конфигурация прибора – предусматривает возможность изменения конфигурации прибора по желанию исследователя.

       Эксплуатация спектрометров динамического рассеяния света существенно проще, чем элетронных и зондовых микроскопов. Особо следует подчеркнуть вопрос простоты пробоподготовки. Простота их эксплуатации позволяет рассматривать вопрос об их массовом применении в больницах и школах.

 В экономическом плане спектрометры квазиупругого рассеяния существенно дешевле электронных и зондовых микроскопов. (см. рис.  12). Ситуация может быть еще существенно изменена в сторону уменьшения стоимости при организации массового производства приборов.

 

Оценка стоимости изделия при серийном производстве на территории Российской Федерации

При организации серийного производства цена одного прибора может быть снижена до 150 – 300 тыс. туб. Основанием для такого утверждения является рассмотрение стоимости отдельных комплектующих, входящих в состав прибора.  Помимо этого, известно, что при серийном производстве первоначально созданная дорогая оснастка облегчает и удешевляет изготовление серийных комплектов.

 Дополнительная информация

Потенциальными потребителями разрабатываемой продукции и услуг являются предприятия индустрии наносистем и наноматериалов как с государственной, так и с частной формой собственности. На первом этапе большую часть спроса могут составить учебные институты и средние учебные заведения. Простейший вариант прибора может устанавливаться даже для ознакомления с проблемами нанотехнологий в старших классах общеобразовательных школ.

Реализация проекта будет способствовать появлению новых научных и прикладных направлений, созданию новых рабочих мест. Предлагаемая разработка позволит российской промышленности выйти на мировой рынок высокотехнологичного оборудования с новым продуктом – лазерным спектрометрическим приборным комплексом.

 

Приложение №1

Обоснование необходимости приоритетного развития

средств ранней диагностики онкологических заболеваний.

 

За последние несколько лет, по данным РАМН и популяционного онкологичекого регистра (см. таблицу), отмечен рост онкологических заболеваний, который оценивается в 17%.

Рост онкопатологии произошел преимущественно за счет опухолевых заболеваний желудочно-кишечного тракта и молочной железы.

Онкологические заболевания будут прогрессировать и в дальнейшем. Причин, вызывающие рост онкопатологии, очень много, среди них:

1.      экологические – состояние воздушной среды, вод и почв;

2.      пищевой рацион – как вследствие ухудшения экологии, так и за счет трансгенных продуктов;

3.      ятрогенные -  характер новых лекарственных препаратов, неоправданный прием антибиотиков, отсутствие контроля за производством и внедрением лекарственных средств, пищевых добавок и т.д.;

4.      отсутствие контроля качества производимых табачных изделий;

5.      изменение состава бытовой химии.

В качестве скринингового метода предлагается лазерная корреляционная  спектроскопия. Метод позволяет исследовать плазму крови, выявляя в ней крупномолекулярные фрагменты, присущие только онкологической патологии. В настоящий момент испытания, проведенные в Южной Корее, позволяют оценивать чувствительность метода в ≥ 80% при специфичности более 90%.

Достоинства метода: себестоимость процедуры отбора и анализа крови около 300 руб., длительность цикла анализа крови 20 мин., способ оценки результатов – компьютерная обработка ( визуальный контроль также очень прост).

Единственной альтернативой этому методу  являются прочно вошедшие в клиническую практику онкомаркеры. Однако их чувствительность и специфичность, за исключением PSA (рак простаты) и альфафетопротеина (первичный рак печени), ниже всяческой критики.

Далее приведена статистика заболеваний в Санкт-Петербурге.

Неполнота материалов обусловлена тем, что в нашей стране не только отсутствует полноценная статистика онкологической патологии, но полностью отсутствует информация о государственных расценках на операции, препараты и т.д.

Таблицы представлены из популяционного онкологического регистра Санкт-Петербурга, являющегося одним из двух официальных изданий России, признаваемых за рубежом. Представлено издание за 2002 год.

 

Распространенность злокачественных новообразований в России в 1997-2007 гг.

(численность контингентов больных на 100 000 населения)

Динамика показателя заболеваемости подросткового населения

Санкт-Петербурга по основным классам болезней в 2009-2010 гг., на 1000 населения

 

     Класс заболеваний

Общая заболеваемость


 

2009

2010

прирост в 2010 к 2009, %

Всего

3351,9

3553,2

6,01

из них:


 


 


 

некоторые инфекционные и паразитарные болезни

71,8

85,5

19,08

новообразования

14,4

18,4

27,59

болезни крови и кроветворных органов и отдельные нарушения, вовлекающие иммунный механизм

9,5

10,1

6,21

Приложение 2

Инструкция

по подготовке проб для тестирования

 

Процедура подготовки проб для тестирования состоит из двух этапов: изготовления сыворотки и приготовления проб.

Технология изготовления сыворотки

1                     Кровь  берется   натощак  в  количестве  5мл  у  каждого
пациента,     желательно     самотеком     в     герметически
закрывающуюся  пробирку с малым  1-1,5см3 объемом
воздуха между поверхностью крови и пробкой. Каждая
партия (не более чем из  10-15) пробирок помещается в
термостат
температурой 37°С на 60 минут.

2                     Затем пробирки с кровью переносятся в холодильник с
 температурой (5-6)°C и   выдерживаются    при этой
температуре 60 минут.

3                     После этого партия пробирок вынимается из холодильника.
В каждой пробирке производится обводка. Сразу после
обводки каждая пробирка снова герметически закрывается.
Данная   партия   пробирок   помещается   в   центрифугу.
Центрифугирование     производится     30     минут   при
скорости вращения 1500 оборотов в минуту.

4                     После    центрифугирования    из    каждой    пробирки    из
центральной части сыворотки над сгустком пипеткой
забирается    1,5мл   сыворотки,   которая   переливается   в
другую герметически закрывающуюся пробирку объёмом
1,5 мл так, чтобы объем  воздуха между поверхностью
сыворотки и пробкой был минимален.

Внимание: следить за тем, чтобы при заборе сыворотки не затронуть сгусток!!!

5            Провести    визуальный    контроль    качества    отобранной
сыворотки.   Сыворотка   должна   быть   прозрачной,   ие
содержать взвеси (мути), медузообразных образований и
пленки на поверхности.

Если сыворотка не удовлетворяет этим требованиям, то она не пригодна для тестирования.

6    Поместить всю партию герметически закрытых ампул с сывороткой в холодильник с температурой 5-6°С, где сыворотка должна находиться до проведения измерений. Так как тестирование занимает определенное время, то при проведении измерений следует последовательно брать из холодильника по нескольку (4-5) проб для тестирования.

Внимание: время между забором крови и ее тестированием не должно превышать 8 часов!!!

Технология изготовления проб для тестирования

Пробы для тестирования представляют собой 4% растворы
сыворотки в дистиллированной воде, предназначенной для
инъекций, с добавлением 100мкл 0,02М (молярного) водного
раствора щелочи NaOH в дистиллированной воде. Используются
ампулы с дистиллированной водой объемом 5мл и диаметром
18мм фирмы.

1.     Подготовка  ампул  заключается  в  удалении  наклейки  и
промывки   поверхности   ампул   ацетоном   для   удаления
следов клея.

2.                                        Раствор   щелочи  изготавливается   в  два  этапа.   Сначала
изготавливается раствор, содержащий 1моль NaOH. Для
этого в чистый стеклянный флакон с притертой пробкой
(емкостью  50мл)  заливается   20мл  дистиллированной
воды,    предназначенной    для    инъекций,    в    которую
добавляется 0,8г порошка
NaOH.

Раствор тщательно перемешивается. Полученный 1М раствор является базовым.

Затем в чистый флакон с притертой пробкой такой же емкости (50мл) заливается 20мл дистиллированой воды и добавляется 400мкл базового 1М раствора щелочи.

Полученный      таким      образом      0,02М      раствор используется для изготовления проб.

 Внимание:     время     использования     раствора     после изготовления не должно превышать 6 суток!!!

3        Пробы изготавливаются следующим образом

Ампула, содержащая 5мл дистиллированной воды, открывается и помещается в гнездо смесителя.

Включается смеситель.

Затем из центральной части пробирки с сывороткой, взятой из холодильника, дозировочной пипеткой забирается 200мкл сыворотки. Удобно использовать дозировочные пипетки на 20-200мкл. При этом должны использоваться наконечники к дозировочным пипеткам с длинными тонкими концами производства, например, фирмы .... Наконечник пипетки с сывороткой вводится в ампулу, находящуюся в смесителе. Окончание наконечника пипетки должно находиться в верхней части воды на расстоянии от центральной оси равном 0.5 радиуса ампулы (см рис).

 

 

Сыворотка вводится в воду медленным нажатием плунжера пипетки за время 10-15 секунд. Затем, не вынимая наконечника пипетки из жидкости, раствор снова набирается в пипетку и впрыскивается в ампулу. Эта процедура повторяется несколько (5-7) раз, чем обеспечивается хорошее перемешивание.

После того, как содержимое пипетки последний раз выдавливается в раствор, пипетка с нажатым плунжером вынимается из ампулы и наконечник отстреливается. Смеситель при этом не выключается

Затем другой дозировочной пинеткой забирается 100мкл 0,02М раствора щелочи и медленно вводится во вращающуюся ампулу с жидкостью. Затем производится процедура перемешивания аналогичная указанной выше, и смеситель выключается.

Удобно сразу изготавливать 4-5 проб и затем проводить тестирование, так как минимальное время между изготовлением пробы и началом ее тестирования должно быть не менее 10 минут.

Внимание: при каждой операции (заборе сыворотки и заборе раствора щелочи) должны использоваться только новые наконечники для дозировочных пипеток!!!

4   Тестирование проводится по программе, приведенной в отдельной инструкции

Если при тестировании наблюдаются выбросы цифровых значений на табло (отклонения какого-либо значения от полученных ранее или после в несколько раз), что указывает на присутствие в растворе взвешенных частиц, волокон или пылинок, то полученный результат является неверным и следует произвести измерения на пробе, изготовленной заново.

Необходимые для тестирования приспособления и материалы

1.           Дистиллированная вода для инъекций в ампулах по 5мл
диаметром 18мм.

2.                            0,02М раствор щелочи NaOH объемом не менее 20мл.

3.                            Две   дозировочные   пипетки   на   20-200мкл   со   съемными
наконечниками,   имеющими   тонкие   концы   (одна   -   для
дозировки сыворотки и другая - для дозировки раствора
щелочи)

4.                            Дозировочная пипетка на 1,5мл для отбора сыворотки после
центрифугирования   и   переливания   ее   в   пробирки   для
хранения.

5.   Смеситель,    обеспечивающий     при     изготовлении    проб
вращение ампулы с раствором со скоростью 2 об/мин.

 

Приложение 3

Исследование вирусов

 с использованием спектроскопии квазиупруго рассеянного света

 

Исследование вирусов ВИЧ и гепатита А

 

Вирус иммунодефицита человека независимо открыли в 1983 году в двух лабораториях: - в Институте Пастера во Франции под руководством Люка Монтанье, и в Национальном институте рака в США под руководством Роберта Галло. Вирус HTLV-3 Галло и вирус LAV Монтанье - это один и тот же вирус -  вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).  Вирус иммунодефицита человека, уже более 25 лет, привлекает внимание исследователей. Подвергавшееся вначале сомнению само существование вируса, вскоре сменилось огромным шквалом различных исследований. Проводились не только электронно-микроскопические исследования (см. Рис. 5), но и атомно-силовая микроскопия (АСМ), а также масс-спектрометрические исследования. Вирус ВИЧ, как было определено, имеет икосаэдрическую симметрию, и близок  к эллипсоидальной форме (Рис. 5, любезно предоставлен авторам). Диаметр вируса по порядку величины  составляет 10-7 м, и  близок  к 70 - 120 нанометрам.

Размер вируса ВИЧ имеет важное самостоятельное значение. Это не просто еще один измеряемый параметр вируса, это отличительный метрологический признак и характеристика, важный как для идентификации вируса ВИЧ, так и для характеристики штамма вируса. Поскольку “обезвреженный” вирус ВИЧ планируется использовать для генной доставки, проблемы паспортизации и метрологического контроля становятся актуальными.

Образцы для исследования.

Штаммы вируса.

В работе были использованы для сравнительного анализа разные по размерам вирусы: культуральный штамм вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) H9/IIIB и  культуральный вакцинный штамм вируса гепатита А (ВГА) ИВА.

Клеточные линии.

Для размножения ВИЧ in vitro использовали перевиваемую линию клеток  МТ-2-Т-лимфоциты человека, а для размножения ВГА линию ВНК-21 (с 13) – клетки почки эмбриона сирийского хомячка. Линии были получены из коллекций клеточных культур: ATCC  (Американская коллекция клеточных культур ),  Института цитологии РАН (Санкт-Петербург) и Института вирусологии РАМН (Москва).

Среда размещения исследуемого объекта.

Перед началом измерений исследуется растворитель или среда размещения исследуемого объекта т.к. для оптических экспериментов вопрос подготовки образца к исследованиям имеет первостепенное значение

В эксперименте в качестве среды размещения вирусов использовался фосфатно-солевой буфер Дюльбеко (DPBS). Результаты исследования приведены на рис. 2.

Слева на рисунке 2 показан результат измерения буфера приобретённого в аптеке изготовленного на специализированном предприятии. Справа – буфер приготовленный в лабораторных условиях (традиционно). 

Как видим, результаты исследований двух буферов разительно отличаются друг от друга.

В лабораторном мы наблюдаем достаточно большое количество (около35% по массе) объектов с размером 150 – 170 нм и 900 – 1100 нм, в то время как в аптечном -  зона от 0 до 1000 нм совершенно чиста. Хотя при применении процедуры регуляризации результат исследования при наличии посторонних объектов и не искажается, точность определения параметров изучаемого объекта уменьшается по мере роста вклада посторонних примесей, соответственно сильно усложняется анализ полученных результатов. Присутствие крупных объектов с характерными размерами от единиц до десятков мкм объясняется присутствием единичных частиц пыли в растворе появляющихся как в процессе подготовки объекта, так и собственно в процессе измерения. Но поскольку массовая концентрация пыли существенно меньше массовой концентрации исследуемого объекта, а размер – больше, то соответственно их коэффициент диффузии  меньше и вклад в рассеяние на них присутствует в низкочастотной части полученного спектра сигнала от рассеянного излучения.

Гепатит А

Для проверки достоверности получаемых результатов первым объектом исследований был культуральный вакцинный штамм вируса гепатита А (ВГА) размер которого хорошо известен D=27 nm. На рисунке 3 показан результат измерения методом ЛКС на рисунке 4 - снимок с электронного микроскопа. Как видим, результаты, полученные обоими методами очень хорошо коррелируют между собой. Оба метода позволяют обнаруживать изучаемый объект (на рисунках отмечен цифрой 1) и наличие его конгломератов.

 

ВИЧ

Вирус иммунодефицита человека, уже более 25 лет, привлекает внимание исследователей. Вирус ВИЧ, как было определено, имеет икосаэдрическую симметрию, и близок  к эллипсоидальной форме (Рис. 5). Диаметр вируса близок  к 70 - 120 нанометрам.

Авторам удалось провести электронно-микроскопические исследования, исследования на атомно-силовом микроскопе JPK Nanowizard, и впервые были проведены исследования методом ЛКС (рис 6 – 8). В работе был использован культуральный штамм вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) H9/IIIB.

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/4/4c/HIV-1_Transmission_electron_micrograph_AIDS02bbb_lores.jpg

 

Таким образом, полученные результаты сравнительных исследований вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и гепатита А методами АСМ, ЛКС и ЭМ хорошо коррелируют друг с другом.

 

Приложение 4

 

Определение параметров наноструктур на основе иттербиевого комплекса 2, 4-диметоксигематопорфирина и их коньюгатов  с БСА методом ЛКС.

Большой интерес к иттербиевому комплексу 2, 4-диметоксигематопорфирина IX (ИКДГ) обусловлен тем, что он обладает уникальными спектрально-люминесцентными характеристиками:

- высоким коэффициентом экстинкции (1,5х105 М-1 см-1);

- большим временем жизни люминесценции (более 10 μs);

- люминесцентным сигналом повышенной интенсивности в ИК-области спектра (900-1100нм), что позволяет детектировать данную субстанцию в растворах при концентрациях порядка 10-8 M и менее;

- значительным (>250нм) разнесением полос возбуждения и регистрации люминесценции;

- квантовым выходом >1%.

Кроме того, эта субстанция принадлежит к натуральным порфиринам и, следовательно, мало токсична.

Поэтому в настоящее время ведутся интенсивные работы по использованию данного соединения для люминесцентной диагностики (ЛД) визуально и  эндоскопически доступных форм рака в качестве чисто диагностического малотоксичного фотосенсибилизатора (МФС).

ИКДГ востребован также и в тераностике - новом тренде современной нанобиотехнологии.

Данное направление подразумевает создание многофункциональных наноструктур, которые совмещают терапевтические и диагностические свойства в одной частице, в связи с чем, становится возможным проведение люминесцентной диагностики с последующей лазерной термодеструкцией опухолей (в том числе с помощью плазмонного резонанса). Следует также отметить, что введение иона иттербия в порфирин приводит к снижению фотохимической активности фотосенсибилизатора, сохраняя при этом свойственную большинству порфиринов тропность к злокачественным опухолям.

Способность порфиринов и их металлокомплексов накапливаться в злокачественных опухолях лежит в основе фотодинамической терапии и ЛД онкологических заболеваний. Избирательность доставки порфиринов в раковые клетки увеличивается при использовании коньюгатов металлокомплексов порфиринов (МКП) с сывороточными альбуминами. Альбумин плазмы крови является одним из главных транспортных белков в организме.

Следует также отметить, что в плазме крови вторыми после альбумина эндогенными носителями являются  липопротеины, которые, как известно, служат транспортерами для относительно гидрофобных лекарственных форм. Липопротеины очень привлекательны для транспортной  доставки лекарств к опухолевым клеткам, имеющим большое количество липопротеиновых рецепторов. Это приводит к большой селективности накопления липопротеинов по сравнению с нормальными клетками. Все это и объясняет, почему амфифильные МКП имеют существенно более высокую селективность накопления в опухолях. Однако известно, что селективность накопления в опухоли в значительной степени зависит от размеров субстанций. В ряде работ, было показано, что зависимость накопления наночастиц  (таких как липосомы, ФС «Тиосенс» и т. д.) от их диаметра имеет немонотонный характер с максимумом 75-130нм (размер, близкий дефектам эндотелиального слоя новообразованных «дырявых» сосудов опухоли: 100-200нм)).  С другой стороны, чем меньше размер наночастиц, тем меньше вероятность захвата их ретикуло-эндотелиальной системой живого организма, и тем больше время их циркуляции в крови. В связи с этим определение параметров размерности лекарственных веществ и их коньюгатов с альбумином является актуальной задачей.

Рис.9п. Гистограммы распределения по размерам полученные с помощью лазерного спектрометра динамического рассеяния света КУРС – 3. (а – иттербиевый комплекс 2, 4-диметоксигематопорфирин; б – бычий сывороточный альбумин (БСА);  в - комплекс ИКДГ с БСА через 55 минут, г - комплекс ИКДГ с БСА через 24 часа).  

Высокое значение селективности накопления данных субстанций может быть связано с размерностью данных комплексов. Измерения показали, что более 95% от общего количества субстанции имеют размер около 5нм, что составляет примерно половину от размера молекулы сывороточного альбумина (9нм) [Алехин и др. Ж. Российские нанотехнологии, Т.5, №9-10], что подтверждается измерениями, проведёнными  на лазерном спектрометре динамического рассеяния света КУРС – 3 (Рис.9б). В работе  [Ferrer M. L. Et al. J. Biophys., v. 80, 2001, p.2422-30] было показано, что размер мономера дейтеропорфирина по оси:  CH3-порфириновое кольцо-CH2-CH2-COOH составляет 1,4 нм. Размер молекулы  ИКДГ несколько больше молекулы дейтеропорфирина и может быть примерно оценен величиной около 2нм. Таким образом, можно заключить, что в растворе  ИКДГ в основном присутствует в форме димера (Рис.9 а).

Используя возможности метода квазиупругого рассеяния обнаруживать весьма малые изменения исследуемого объекта при сравнении спектров света, рассеянного образцом до и после изменения условий авторами были проведены исследования образования коньюгата ИКДГ/БСА (Рис.9 в, г).

Таким образом, средний размер коньюгата составляет 20-30нм.

Как было показано в работе [Г. Е. Добрецов, Т. И. Сырейщикова, Ю. А. Грызунов, Н. В. Смолина, А. А. Комар. Ж. Биофизика. Т. 55, Вып. 2. С. 213-219. 2010],  суммарное количество специальных центров в молекуле альбумина, способных связывать многие типы лекарств и красителей, составляет не менее 2 единиц. В результате средний размер коньюгата, измеренный методом квазиупругого рассеяния света, совпадает с расчетными данными теоретических исследований (9нм+5нм+5нм=19нм). Коньюгаты ИКДГ/БСА (средний размер 20-30нм), имеют высокую селективность накопления в опухоли, которую мы связываем с их размерностью (большое время циркуляции в кровотоке), а также амфифильностью ИКДГ (попадание в ткани опухоли благодаря липопротеинам). 

Результаты эксперимента образования коньюгата ИКДГ/БСА методом квазиупругого рассеяния света убедительно показывает перспективность данного метода в изучении динамики изменения исследуемых биообъектов.